Il teatro venne dedicato alla Regina Margherita di Savoia in occasione della sua visita a Caltanissetta nel 1881. La sua costruzione fu ultimata nel 1873, e venne inaugurato nel marzo 1875 con la rappresentazione del "Macbeth" di Giuseppe Verdi. L'edificio prese il posto dell'antica chiesetta rurale di San Giacomo, esistente sin dal XIV secolo, distrutta dopo la soppressione degli ordini religiosi.

Il teatro fu più volte ristrutturato e le sue funzioni d'uso si modificarono notevolmente fino a diventare un cinema di seconda categoria, con bar all'interno. Esso venne inoltre pesantemente colpito dai bombardamenti americani del 1943. Nel 1970 venne dichiarato inagibile e chiuso, e nel 1973 vennero avviati i lavori di restauro che si protrassero per oltre 20 anni.
Il teatro venne riaperto ufficialmente al pubblico il 31 ottobre 1997 con un concerto dell'Orchestra sinfonica siciliana di Palermo diretta dal maestro Gabriele Ferro. Oggi il teatro Regina Margherita rappresenta il cuore culturale di Caltanissetta e vi vengono organizzate kermesse di ogni tipo, dalla lirica, al cabaret, passando per il teatro di ricerca sperimentale della rassegna teatrale "Rossofestival".